Al igual que otros intelectuales liberales que alcanzaron una importante figuración pública, Diego Barros Arana inició una inevitable carrera política, donde realizó valiosos aportes al país. Su participación parlamentaria se inauguró en 1855, cuando fue elegido diputado suplente por Valdivia. Lamentablemente, su tenaz oposición al gobierno de Manuel Montt provocó el allanamiento de su casa, viéndose obligado a salir al exilio. Regresó en 1861 y sólo en 1867, cuando aún era rector del Instituto Nacional, fue nombrado diputado por San Fernando gracias al apoyo del Presidente José Joaquín Pérez. Lo reeligieron en 1870 y en 1886 ocupó el cargo de diputado por Putaendo.

Pero su actuación política más relevante se desarrolló a partir de 1876, cuando bajo el gobierno de Federico Errázuriz Zañartu, fue nombrado ministro plenipotenciario ante los estados de la República Argentina y el Imperio de Brasil. Debido a su erudición y los estrechos vínculos que mantenía con ciudadanos argentinos, se le encomendó solucionar la cuestión de límites entre Argentina y Chile. La tarea fue abrumadora. Barros Arana sabía que la documentación colonial favorecía la posición chilena, sin embargo, las constituciones republicanas chilenas habían manifestado constantemente que la frontera con Argentina era la Cordillera de los Andes. Finalmente, durante el gobierno de Aníbal Pinto, se firmó el tratado de límites definitivo que estableció como límite la línea propuesta por Barros Arana al norte del Estrecho de Magallanes y la aceptación de la divisoria de las aguas en la cordillera como criterio de definición.